关于点突变细胞株的实验tips—源井生物【干货】2021/7/22 11:08:26

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  目前许多研究结果都表明CRISPR/Cas9系统有望成为构建人类疾病模型的主要工具,如人多能干细胞和肿瘤细胞系。通过现代测序,CRISPR/Cas9技术可以在各种细胞系中引入精确的点突变(纯合/杂合),并且能够构建人类疾病模型。这对于研究疾病的治疗和基础基因组都是十分有利的。干细胞技术https://www.snclifevault.com/SNC华夏源生命库专注于细胞技术应用服务,提供细胞存储,免疫细胞治疗,干细胞治疗,细胞抗衰诊疗及应用服务,公司研究开发多种疑难疾病的细胞治疗临床应用方案,1对1服务大众!


  我们本周也收到了一些关于利用CRISPR/Cas9技术实现细胞点突变的一些问题,下面就分享给大家:

  A:首先通过CRISPR/Cas9高效地引入靶向双链断裂(DSB),这些DSB在同源定向修复(HDR)系统修复下使用DNA修复模板(例如引入的单链寡DNA核苷酸,即ssODN),从而完成特定突变的敲入。

  重要的是,我们还可以基于CRISPR/Cas9系统的敲入基因组编辑框架选择性引入单等位基因和双等位基因的序列变化,以及引入杂合和纯合点突变,以构建致病性疾病模型。纯合点突变需要gRNA靶向接近目标突变的位置,而杂合点突变可以通过距离依赖性次优突变的掺入或通过使用混合修复模板来实现。所以,CRISPR/Cas9技术介导的敲入点突变对于功能获得(GOF)或功能丧失(LOF)研究非常有用。A:如果是做内源性的点突变,hepG2这个细胞有些难度,因为细胞增值速度较慢,而且单克隆形成率不高,顺利情况下,大概需要3-4个月。所以小源建议,这种类型的实验其实可以选择外包服务,源井生物有hepG2细胞的成功编辑经验,并且在我们这里构建点突变细胞系还可以免费赠送KO细胞系,让你的实验更方便。A:Donor载体其实就是在把突变的位点引入后,再加上上下游的序列即可,上下游的序列一般要1-2kb左右,起到同源重组的目的,也可以用Oligo来引入突变,Oligo相比于Donor来说,上下游的序列短很多,一般100-200bp就够了。关于预算的问题,构建一套点突变系统的载体和oligo大概5千左右吧。